高效液相色谱方法的选择

2019-11-01 11:38:00
立即下载

高效液相色谱方法的选择

一、色谱模式的选择

(一)样品性质

高效液相色谱方法有很多模式,选择哪种模式能满足分析的要求,首先要考虑分析对象的物理和化学性质。也就是要考虑:

① 样品是大分子还是小分子?分子量在什么范围?

② 样品是水溶性还是有机溶剂可溶性?

③ 样品是离子状态还是非离子状态?

(二)根据样品性质选择合适的模式

在选择高效液相色谱模式时,首先要了解的是样品的溶解性,如果不知道它的溶解性,可以用戊烷或氯仿和水作溶剂做一下溶解试验,如果知道所做样品的化学结构也可以估计它在水或有机溶剂中的溶解性。其次,要了解的是样品样品的分子量大小,如果不知道样品的分子量,可以用体积排阻色谱法分离,得出数据。按照排阻色谱法,既可以用于水溶性样品又可以用于油溶性样品的分离。用排阻色谱法可以估计样品简单还是复杂,用排阻色谱法也可以分离分子量大小不一的组分。可用它来考察样品中是否含有一些分子量很接近的组分,如果样品中只含有分子量差别不大的组分,就需要使用高效液相色谱法的其他模式进行分离。

1、水溶性样品

如果是低分子量的样品,而且分子量相差较大,使用小孔填料的排阻色谱法进行分离是比较合适的。如果样品中的分子量相差不大,就要考察样品中是否含有离子型或可电离的组分,如样品中都是非离子型的,最好选用键合相色谱分离,并且应首先试用反向色谱。

   如果是低分子量离子型(或是可电离的)样品,有几种方法可以利用,若为弱酸或弱碱,最为简单的办法就是完全抑制的电离。例如羧酸样品中使用pH值为1-2之间的流动相,就可以把样品作为非离子型样品进行分离。但对强碱性样品(pKa>6)不能使用离子抑制技术,因为不可能把流动相的pH值增大到足以抑制样品电离而又不破坏固定相基质的程度。强碱性样品应和强离子型样品一样,用离子对色谱进行分离。

强离子型水溶性大分子是目前高效液相色谱法的重要课题之一。像蛋白质、核酸的分离是近几年研究十分活跃的领域。

 HPLC是分离分析生物大分子生化样品中应用最为广泛的方法,各种分离模式(反向色谱、正向离子交换色谱、体积排阻色谱、疏水作用色谱和亲和色谱等)都有应用。所用的反向色谱柱多为C18----C8键合硅胶填料,这种填料有较大的微孔,并把键合以后残余的硅醇基用三甲氯硅烷封闭。

2、油溶性样品

  在分离油溶性样品时,开始的步骤与水溶性样品相似,首先应使用体积排阻色谱法确定样品分子量大小的特征。分子量较大的样品可以用适当的打孔硅胶或有近凝胶填料,以有机溶剂为流动相做进一步的分离。对于分子量范围在1000--5000的样品,可以使用排阻色谱或硅胶吸附色谱。

   对于分子量低于2000的样品,如果样品中只有几个组分,而且分子量相对较大,使用小孔硅胶或其他凝胶填料的排阻色谱更容易实现分离,在此情况下也可以使用反向色谱进行分离。

对于非离子型样品,如果是强亲酯性的,可以使用有机溶剂为流动相的硅胶吸附色谱。

二、色谱条件的选择

在色谱模式选定之后,就要确定分离的色谱条件,各种色谱模式的条件虽各有特点,但是不外乎是:色谱柱、流动相、梯度或等度洗脱、流动相六度等,下面把选择的一般程序列于图1-1的流程中

             

图片关键词图片关键词

1-1 高效液相色谱条件选择程序